RTPCR，反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。

rt-pcr影響因素

RT-PCR反應(yīng)受多個因素影響，如硫酸鎂的濃度, 引物退火的溫度，擴增的循環(huán)數(shù)等。

1、建議選擇0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸鎂作初步實驗。

2、對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。

3、大多數(shù)目標RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果目標RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴增的次數(shù)到45-50次。

rt-pcr操作步驟

1、從RNA(或mRNA)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：

2、于95℃加熱5～10min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，使RNA—cDNA雜交體變性，然后迅速冰浴冷卻：

3、PCR擴增：方法基本同PCR。

cDNA第一鏈合成方法：20ul反應(yīng)液中含10xPCR擴增緩沖液，2ul;四種dNTP(10 mmol/L)2ul;RNA酶抑制劑20U;mRNA，l～2ug(或RNA 5-10ug);AMV，20U;引物，1u;最后用滅菌水補至20ul。 以上溶液充分混勻后，于42℃反應(yīng)60min，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)管在95℃下加熱5min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活和RNA—cDNA雜合物變性。其后反應(yīng)液則可置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>